Cloning and Expression Analysis of atp6 Genes between Cytoplasmic Male Sterile Line and its Maintainer Line in Bunching Onion

Wang Qinghua ¹　Zhang Rongting ²　Jia Shujuan ^3*　Gao Limin ^1*

1 Vegetable and Flower Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences/ Shandong KeyLaboratory of Greenhouse Vegetable Biology / Shandong Branch of National Vegetable Improvement Center / Vegetable Science Observation and Experimental Station in Huang-Huai District of Ministry of Agriculture, Jinan, 250100; 2 Jinan Institute of Agricultural Sciences, Jinan, 250316; 3 Jiyuan Agricultural Comprehensive Development Office, Jiyuan, 459000

* Corresponding authors, jsjuan888@163.com; lmgao1201@163.com

Abstract　In order to further study the relationship between atp6 gene and Cytoplasm male sterility (CMS) of bunching onion, the sequence of atp6 gene was obtained from male sterile line and maintainer line of Zhangqiu onion bunching using homologous cloning. The protein secondary structure and the expression of atp6 gene in different growth stages were compared. The results showed that there was one polymorphic locus (A/T) at the 171st base of the open reading frame of atp6 gene in CMS line and maintainer line, which changed the proportion of protein secondary structure slightly, but did not change the transmembrane structure of ATP6 protein. The expression of atp6 gene in roots and leaves/flowers at seedling, bolting, flowering and late flowering stage was detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction. The results showed that the expression of atp6 gene in root showed a trend of increasing at first and then decreasing during the whole development of the plant, reaching the maximum at the flowering stage, and the expression of the maintainer line was 1.14 times higher than that of the CMS; The expression of atp6 gene in leaves/flowers decreased gradually during the whole growth period, and reached the highest level at the seedling stage, and the maintainer line was 1.96 times higher than that of the CMS.

Keywords　Bunching onion, atp6 gene, Cloning, Expression analysis

大葱(Allium fistulosum L.)是非常重要的香辛类蔬菜，是中国人日常生活中必不可少的蔬菜和调味品，其味辛、性温、生食或熟食皆宜，具有开胃消食、抗癌、抗肿瘤、保护心血管、降血压、提高人体免疫力和防止衰老等保健功能。

细胞质雄性不育(CMS)是一种母性遗传性状，主要表现为植株不能产生有功能的花粉，这种现象由Jones于1936年在洋葱(Allium cepa L.)中首先发现(Jones and Emsweller, 1936; Jones and Clarke, 1943)。研究表明植物CMS与线粒体基因异常有关，1976年，Levings and Pring 研究发现玉米(Zea mays L.)雄性可育细胞质和雄性不育细胞质线粒体DNA间存在明显的酶切图谱差异，这一研究发现从分子水平上直接证明了玉米CMS与线粒体DNA基因差异密切相关。高等植物线粒体基因组在进化过程中经常发生重排或重组，会产生较多嵌合的开放阅读框(orfs)，其中就可能产生诱导CMS的基因(Hanson and Bentolila, 2004)。atp6基因是F1F0-ATP 合成酶系统的重要组成部分 (Ji et al., 2013)，序列突变将会影响合成编码氨基酸，影响ATP合成酶的功能，干扰花粉发育过程，从而导致植物CMS的发生(Dieterich et al., 2003)。

为了进一步研究atp6基因与大葱细胞质雄性不育的关系，本试验通过同源克隆的手段得到大葱atp6基因序列，并对其在蛋白质二级结构和生长发育各时期atp6基因表达量等方面进行分析比较，为揭示大葱CMS的分子机理提供一定理论依据。

1结果与分析

1.1大葱根、叶、花总ＲNA质量检测

提取的总RNA经过紫外分光光度计测定，OD260与OD280的比值在1.9~2.0范围之间，A260与A230的比值在2.0~2.3范围之间，表明提取的RNA纯度较高。经1%琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，结果显示28S、18S条带清晰，表明RNA完整性较好，可以用于后续试验。

图1 大葱根、叶、花总RNA 提取检测 Figure 1 Extraction and detection of total RNA of root, leaf and flower from bunching onion

1.2大葱atp6基因序列分析

利用GenBank中大葱atp6假基因(GenBank Accession No.JQ283733.1)序列设计引物atp6-F1和atp6-R1扩增大葱雄性不育系980128A与保持系980128B的总DNA，PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，在不育系与保持系上均获得约800 bp片段(图2)，与预期片段大小相吻合,条带清晰，测序结果显示该扩增片段长度均为806 bp。通过TAIL PCR获得5’与3’的侧翼序列，找到起始密码子和终止密码子，得到atp6基因全长序列819 bp (Gao et al., 2018)。通过单克隆测序发现大葱S型(不育)细胞质具有T- atp6基因型(GenBank No. KR973431)，N型(可育)细胞质具有T- atp6和A- atp6 (GenBank No. KR973430)两种基因型，也有一部分的N型细胞质只具有A- atp6基因型(图3)。

图2 大葱atp6基因PCR电泳结果 Figure 2 PCR electrophoresis results of atp6 gene in Bunching onion

图3 单克隆测序检测atp6基因171位点单碱基(A/T)差异 注: A: 不育系; B、C: 保持系 Figure 3 Polymorphic locus (A/T) at the 171st base of the atp6 gene by monoclonal sequencing Note: A: CMS line; B、C: maintainer line

1.3大葱atp6基因雄性不育系与保持系氨基酸序列分析

我们对所获得的两种atp6基因与atp6 假基因序列(GenBank No. JQ283733.1)进行了差异序列比较(图4)。发现A-atp6与T-atp6在170位点比JQ283733.1序列多了一个T碱基，从而使不能编码氨基酸的JQ283733.1序列变成了完整的atp6基因。在194位点有一个G/T的碱基差异，JQ283733.1序列为T，A-atp6与T-atp6均为G。A-atp6与T-atp6在171位有一个A/T的碱基差异，A-atp6与JQ283733.1序列均为A，T-atp6为T。大葱atp6基因共编码272个氨基酸，由于171位A/T多态性位点的存在使得57位Leu(L；A-atp6)突变为Phe (F；T-atp6)。

图4 大葱atp6基因与JQ283733.1差异序列分析 Figure 4 Sequence analysis of difference between atp6 genes and JQ283733.1 in Bunching onion

1.4大葱atp6基因编码蛋白特征

采用SOPMA在线软件对大葱atp6基因蛋白质的二级结构进行预测，结果表明A/T单倍型的ATP6蛋白质二级结构均由α－螺旋、延伸链、β－转角和无规则卷曲组成(表1)。由于atp6基因序列的第171位碱基由保持系的A突变为不育系的T，致使氨基酸序列保持系的第57位亮氨酸(Leu)突变为不育系的苯丙氨酸(Phe)，从而使大葱ATP6蛋白质的二级结构比例发生了轻微变化。

表1 大葱atp6 基因编码蛋白氨基酸结构组成预测 Table 1 Prediction of amino acid composition of atp6 gene encoded protein in Bunching onion

通过在线分析软件TMHMM对大葱A-ATP6及T-ATP6两个单倍型蛋白质进行跨膜结构预测，结果表明两个单倍型atp6基因编码蛋白并没有因A/T突变而使跨膜结构域数量改变，5个跨膜结构域依然存在(图5)。

图5 A、T单倍型大葱atp6基因编码蛋白跨膜结构预测分析 Figure 5 Prediction and analysis of transmembrane structure of protein encoded by atp6 gene in A and T haplotype Bunching onion

1.5大葱atp6基因雄性不育系与保持系不同发育时期不同部位RT-PCR分析

对大葱雄性不育系与保持系atp6基因进行定量表达分析(图6)，在植株整个发育过程中，根系atp6基因表达量表现出先升高后降低的趋势，在开花期达到最大值，保持系是不育系的1.14倍；叶/花atp6基因表达量在整个生育期逐渐降低，苗期最高，保持系是不育系的1.96倍。

图6 大葱不同生育时期根系、叶片、花蕾atp6基因的相对表达量 注: A: 保持系; B: 不育系 Figure 6 Relative expression of atp6 gene in roots, leaves and buds of Bunching onion at different growth stages Note: A: maintainer line; B: CMS line

2讨论

许多研究表明，atp6基因是影响植物CMS的一个重要候选基因，王小庆等(2015)比较分析了小麦(Triticum aestivum L.)K 型，V 型不育系和保持系中33个线粒体基因和22个开放阅读框，发现atp6基因在保持系和不育系之间具有较大差异。Tan等(2018)和Fabio等(2020)对茴香的线粒体基因组进行了测序组装，发现两个类型的atp6基因序列，其中atp6-只存在于雄性不育线粒体基因组中，atp6+只存在于雄性可育线粒体基因组中，但是在雄性不育材料中也检测到了atp6+的存在，推测可能存在于细胞核中。本研究表明A-atp6只存在于大葱雄性可育材料中，T-atp6不仅存在于大葱雄性不育材料中，也存在于部分雄性可育材料中。由于本研究是以大葱总DNA为基础，因此不确定存在于部分雄性可育材料中的T-atp6是存在于细胞质中还是细胞核中，而且完全具有A-atp6基因的植株与具有部分T-atp6基因的植株在花粉育性、可育度等方面有无差异，这些内容还有待于进一步的研究与观察。

有些植物基因内部存在的一些单碱基突变，可能会产生雄性不育。周晓娟等(2012)对洋葱不育系和保持系的atp6基因进行了研究，发现洋葱atp6基因上游和基因内部分别存在一个单碱基突变。第一个A/G突变存在于距起始密码子上游第467碱基处，第二个A/C突变存在于atp6基因内部第92碱基处，该突变导致编码氨基酸由丝氨酸(保持系, Ser)突变为酪氨酸(不育系, Tyr)。王振宝等(2014)通过对洋葱不育系与保持系atp6基因的研究，同样发现了该基因内部同一位点存在的这个C/A突变，该研究认为此突变位点在不育系和保持系间随机出现，这可能与试验材料有关。本研究发现大葱雄性不育系与保持系atp6基因间存在的A/T多态性位点，Leu (L; A-atp6)突变为Phe (F; T-atp6)，进而使得蛋白质二级结构比例发生了轻微变化，虽然并未导致跨膜结构域的改变，但并不能排除这一单碱基突变可能会导致雄性不育的发生，有待于进一步遗传转化进行验证。

周晓娟等(2012)通过对比洋葱atp6基因在不育系与保持系中的表达，表明在洋葱开花期，从小花蕾到大花蕾，不育系atp6基因的表达量变化趋势是先升高后降低，而保持系的变化趋势是先降低后升高；小花蕾与大花蕾时期，不育系与保持系差异不大，而中花蕾时期差异较大。Tan等(2018)研究了不育系与可育系胡萝卜atp6基因在开花时期的表达量，可育系在花期的表达量变化趋势是先升高后降低，而不育系在整个花期的表达量变化不大。而本文是对大葱整个生育期atp6基因表达量进行的研究，根系中atp6基因的表达量在开花期最高，叶片中atp6基因的表达量在苗期最高，保持系均高于不育系。而花期花蕾中的表达量在不育系与保持系中差别不大，有可能本文取样是在开花初期，还未到差异表达的时期。

3材料与方法

3.1试验材料

试验材料为章丘大葱雄性不育系与保持系，种植于山东省农业科学院蔬菜花卉研究所试验基地。苗期、抽薹期采样部位为大葱新鲜叶片和新生根；开花期和开花后期采样部位为花蕾和新生根。

3.2大葱基因组DNA与RNA 提取

大葱基因组DNA提取采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒；大葱RNA提取采用植物总RNA提取试剂盒，采用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒合成单链cDNA，总DNA、RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。方法参照操作说明书。

3.3 atp6基因引物设计及PCR扩增测序

根据GenBank数据库中GenBank Accession No.JQ283733.1序列号，采用Primer Premier 5.0设计引物atp6-F1和atp6-R1 (表2)，引物方式纯化为PAGE，委托北京博尚生物技术有限公司合成。PCR反应采用TC-XP-D型基因扩增仪(Bio-Rad公司生产)进行，20 μL的反应体系中，2×Pfu Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L^-1)各1.0 μL，样品DNA 50 ng；反应程序、PCR产物检测、目的片段回收纯化、克隆等操作均参考Gao等(2018)方法进行，略有改动。TAIL-PCR扩增及两端序列的获得参照Liu等(2007)方法。

3.4大葱atp6 基因序列分析

atp6 基因核苷酸序列采用DNAMAN等软件进行生物信息学分析；蛋白质二级结构与跨膜结构预测采用刘玉飞等(2020)方法进行。

3.5大葱atp6 基因RT-PCR分析

根据atp6基因序列设计了一对特异RT-PCR引物RT-atp6-F和 RT-atp6-R，Tublin为内参，引物序列为TUB-F和TUB-R 。分别对大葱不育系和保持系不同发育时期的根、叶、花蕾进行实时荧光定量PCR分析。RT-PCR反应体系为25 μL体系，包含12.5 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ (TAKARA，日本)，上下游引物(10 μmol·L^-1)各1.0 μL，cDNA模板(稀释10倍之后) 1.0 μL，0.4 μL Rox Reference DyeⅡ，9.5 μL ddH₂O；反应程序为：95°C预变性30 s；然后95°C 5 s，60°C 30 s，40次循环。每个样品设3次重复，实时荧光定量PCR分析采用Light Cycler system (Roche Light Cycler480)进行，基因的相对表达量计算采用2^-△△Ct法(Magnus et al., 2005) (表2)。

表2 引物序列 Table 2 Primers

作者贡献

王清华是本实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；张荣亭参与实验设计和试验结果分析；贾述娟给予实验设计建议；高莉敏是本项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作，完成文章的修改与定稿。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由山东省农业良种工程(2019LZGC0703)和济南农业科学研究院科研项目(yy202001)共同资助。

参考文献

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